一、原理
淀粉性种子在萌动过程中,胚释放出来的赤霉素能诱导糊粉层细胞中a-淀粉酶基因的表达,引起8-淀粉酶生物合成,并分泌到胚乳中催化淀粉水解为糖。通过碘试法比色测定淀粉在酶催化反应过程中的消耗量,可以定量分析a-淀粉酶的活力。
二、材料、仪器设备及试剂
(一)材料大麦种子。
(二)仪器设备
分光光度计,恒温箱、水浴锅,移液管、烧杯,试管,青霉素小瓶,镊子,刀片。
(三)试剂
(1)1%次氯酸钠溶液。
(2)0.1%淀粉溶液:淀粉1g,KH2PO48.16g配成mL溶液。
(3)2×10~5mol/L赤霉素溶液:赤霉素6.8mg溶于少量95%乙醇中,再配成mL,然后稀释成2×10~*mol/L、2×10~mol/L、2×10~8mol/L三组溶液。
(4)10°2mol/L醋酸缓冲液:pH4.8,每毫升缓冲液中含有链霉素1mg。
(5)L-Kl溶液:0.6gKI、0.06gL溶于mL0.05mol/LHCl中。
三、实验步骤
(1)选取大小一致、健康的大麦种子50粒,用刀片将每粒种子横切成两半,使之成无胚的半粒和有胚的半粒,分别置于新配制的1%次氯酸钠溶液中,消毒15min,取出用无菌水冲洗数次,备用。
(2)取小瓶6只编好号码,按表2-47-1加入各种溶液和材料,使小瓶中混合液的最后赤霉素浓度分别为0、10~3mol/L、10mol/L、10~mol/L,醋酸缓冲液强度为5×10~*mol/L,链霉素含量为0.5mg/mL,于25℃条件下进行培养24h,最好进行振荡培养,如无条件,则必须经常摇动小瓶。
(3)淀粉酶活力分析:从每个小瓶中吸取培养液0.1mL,分别置于事先盛有1.9mL淀粉磷酸盐的溶液中,摇匀,在30℃温箱或水浴中精确保温10min,然后加L-KI溶液2mL,蒸馏水5mL,充分摇匀,于波长nm下测定吸光度,以蒸馏水作空白,校正仪器零点。读数从标准曲线查得淀粉含量,以被分解的淀粉量作为淀粉酶的活性。
(4)以不同淀粉浓度(0~7μg/mL)及其吸光度绘制标准曲线。
四、结果计算
(1)第1瓶为淀粉的原始量(X)。
(2)第2~6瓶分别为反应后淀粉的剩余量(Y)。
(3)淀粉水解含量=×%。
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