摘要：目的建立玄参药材的HPLC指纹图谱，并同时进行多成分含量测定，为玄参药材等级质量标准的制定提供方法和依据。方法采用HPLC-DAD法，ElipseXDB-C18（mm×4.6mm，5μm）色谱柱，柱温25℃，以乙腈（A）-0.03%磷酸水溶液（B）为流动相进行梯度洗脱，体积流量1.0mL/min，进样量10μL，指纹图谱检测波长nm，含量测定的检测波长为哈巴苷nm、哈巴俄苷nm、肉桂酸nm。获取30批不同等级玄参药材的指纹图谱，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（版）进行分析，同时对3种主要化学成分进行含量测定。结果指纹图谱分析共指认7个共有峰，相对保留时间RSD值均小于2.0%，相对峰面积RSD值差异较大，提示玄参药材中的主要化学成分稳定存在，但含量差异较大；相似度分析中，约有5%的指纹图谱与对照药材的相似度低于0.7，12.5%的相似度在0.7～0.8，40%处于0.8～0.9，42.5%大于0.9，提示不同产地玄参药材的质量差异较大；不同批次玄参药材中3种化学成分含量差异较大，质量分数分别为哈巴苷0.18%～2.89%、哈巴俄苷0.01%～0.35%、肉桂酸0.01%～0.24%。结论建议在原有等级划分标准的基础上，增加指纹图谱和主要化学成分的含量测定两项指标。
《中国药典》年版一部收载的玄参来源为玄参科（Scrophulariaceae）玄参属ScrophulariaL.植物玄参ScrophularianingpoensisHemsl.的干燥根[1]。玄参药用始载于《神农本草经》[2]，其性微寒，味甘、苦、咸，归肺、脾、肾经，具有清热凉血、滋阴降火、解毒散结等功能[3]。作为一味常用中药，由于其具有很强的生长适应性，在全国多个地区均有栽培，如浙江、四川、西藏、云南、湖北、湖南等，带来的问题是药材种质不清、质量不一，药材质量的可追溯性差等诸多问题，使得“质”和“量”均无法保证[4-5]。市场上玄参药材一般为统货，不同产地药材质量参差不齐，现有等级标准为年部颁布的《七十六种药材商品规格标准》[6]，仅根据大小、质量论质，将其性状表观特征作为等级标准划分依据的单一因素[7]，而未考虑品种、产地、部位、加工等其他众多因素的影响[8]，更无法体现化学成分和药效的差异。本研究从玄参药材的HPLC指纹图谱的差异性分析入手，结合主要化学成分哈巴苷、哈巴俄苷和肉桂酸的含量差异探讨玄参药材的等级质量标准，以期为玄参药材等级质量控制提供参考。
1仪器与材料
1.1仪器
Agilent高效液相色谱仪（二级管阵列检测器）、OpenLABCDS色谱工作站（美国安捷伦公司），YPN型电子分析天平（上海青海仪器有限公司），SB-25-12DT超声清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）。
1.2试剂
对照品哈巴苷（批号B）、哈巴俄苷（批号B）、肉桂酸（批号B82）均购自上海源叶生物科技有限公司，质量分数均大于98%，乙腈、甲醇均为色谱纯，磷酸为分析纯，水为怡宝市售纯净水。
1.3药材
不同批次玄参药材均由湖南省药圣堂有限公司收集，经湖南中医药大学中药鉴定教研室刘塔斯教授和周小江教授鉴定为玄参科玄参属植物玄参ScrophularianingpoensisHemsl.的干燥根。～年共收集玄参药材30批次，基本信息见表1。将各批次玄参药材按照《七十六种药材商品规格标准》，根据大小、性状等特征进行初步等级划分成一等品、二等品、三等品，干燥器中保存备用。
2方法与结果
2.1对照品溶液的制备
精密称取哈巴苷、哈巴俄苷、肉桂酸对照品适量，加甲醇配制成质量浓度分别为10.0、1.0、1.0mg/mL的母液，4℃保存备用。
2.2供试品溶液的制备
将玄参药材切片后于60℃烘箱烘烤30min除去部分水分后，打粉，过3号筛，精密称定玄参粉末约1.0g于具塞锥形瓶，加50%甲醇50mL，浸泡1h，超声45min，精密称定质量，用50%甲醇补足损失质量，摇匀，过0.45μm有机滤膜即得。
2.3色谱条件
采用HPLC-DAD法，ElipseXDB-C18（mm×4.6mm，5μm）色谱柱，柱温25℃，以乙腈（A）-0.05%磷酸水（B）为流动相进行梯度洗脱（0～25min，5%～35%A；25～35min，35%～70%A；35～40min，70%～5%A），体积流量1.0mL/min，进样量20μL；检测波长分别为指纹图谱nm，含量测定中哈巴苷nm、哈巴俄苷nm、肉桂酸nm。
2.4不同批次玄参各等级药材指纹图谱分析
根据《七十六种药材商品规格标准》将各批次玄参药材进行初步等级划分过程中发现，部分批次玄参药材个头均较小，未达到一等品要求，如S11、S14、S16、S17、S18、S22批次中无一等品；相反，亦有部分批次玄参药材个头均较大，如S9、S10、S12、S28批次药材则无法分出三等品。因此，HPLC-DAD法共采集玄参一等药材24批次，二等药材30批次，三等药材26批次。
2.4.1玄参药材指纹图谱的共有峰分析采用“中药色谱指纹图谱相似度分析”软件分别对3种等级玄参药材指纹图谱进行分析，发现24批次一等品中共有8个共有峰，30批次二等品中共有9个共有峰，26批次三等品中共有9个共有峰，其中保留时间分别约为3.4、4.7、7.2、18.8、20.7、25.6、29.3min的7个色谱峰在3种不同等级药材的共有峰中均有出现。将3种等级所有批次玄参药材的指纹图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度分析”软件，采用“中位数”法进行峰匹配之后，生成对照谱图，见图1，亦可指认7个共有峰，与3种等级玄参样品的指纹图谱单独分析结果一致，表明这些化学成分的总量能在一定程度代表玄参药材的质量。根据标准品定性，可以指认3号峰（7.2min）为哈巴苷、6号峰（25.8min）为哈巴俄苷、7号峰（29.4min）为肉桂酸。以6号峰哈巴俄苷对参照，对共有峰采用相对保留时间和相对峰面积表示。结果显示所有共有峰的相对保留时间RSD值均小于2.0%，相对保留时间分别为0.（1号峰）、0.（2号峰）、0.（3号峰）、0.（4号峰）、0.（5号峰）、1.（5号峰，S峰）和1.（7号峰）；而所有共有峰的相对峰面积则差异非常大，RSD值表现异常。
2.4.2玄参药材指纹图谱的相似度分析所有批次不同等级玄参共80组指纹图谱的相似度分析结果见表2，从中发现，S27二等品、S28一等品和二等品、S30一等品与对照药材的相似度低于0.7；S3三等品、S8二等品和三等品、S9一等品和二等品、S20三等品、S21二等品、S24二等品、S27一等品、S30三等品与对照药材的相似度在0.7～0.8；其他相似度约40%处于0.8～0.9，42.5%大于0.9；其中，S5、S16、S19、S23、S29批次玄参指纹图谱的等级差异甚微，相似度值均大于0.9。
2.5多指标成分的含量测定
2.5.1对照品及玄参药材的色谱行为按照“2.3”项下，将哈巴苷、哈巴俄苷、肉桂酸3种混合对照品和编号为S1的浙江一等玄参药材供试品溶液分别进样分析，色谱行为见图2。由图2-A可知，哈巴苷、哈巴俄苷、肉桂酸3种有效成分在设定的色谱条件下能有效分离，峰形佳且分离度好，哈巴苷、哈巴俄苷、肉桂酸的保留时间分别为7.、25.、29.min，依次记为1、2、3号峰。图2-B提示玄参药材的色谱图在7.、25.、29.min出现强信号，通过将此3个色谱峰的紫外光谱图与对照品的紫外光谱图进行比对，并结合色谱的定性参数保留时间，判断玄参供试液中1、2、3号色谱峰分别归属于哈巴苷、哈巴俄苷和肉桂酸。
2.5.2线性关系考察配制哈巴苷、哈巴俄苷和肉桂酸质量浓度分别为、、40μg/mL的混合对照品1，依次向下梯度稀释2.5倍，得到混合对照品溶液2～6，按照“2.3”项下方法依次进样；以混合对照品的浓度（C）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表3。线性相关系数均大于0.，表明线性关系良好。
2.5.3精密度试验取混合对照品溶液3，连续进样6次，计算哈巴苷、哈巴俄苷、肉桂酸峰面积的RSD分别为1.15%、1.96%、1.78%。
2.5.4重复性试验根据“2.2”项下方法制备的浙江一等玄参样品溶液6份，按照“2.3”项下色谱条件进样分析，计算得到哈巴苷、哈巴俄苷、肉桂酸峰面积的RSD分别为3.40%、3.59%、3.56%。
2.5.5稳定性试验取供试品溶液，分别于配制后0、1、2、3、4、5d进样分析，计算得到哈巴苷、哈巴俄苷和肉桂酸峰面积的RSD分别为1.09%、1.16%和1.19%。
2.5.6加样回收率试验精密量取以测定的样品S1，按照“2.2”项方法制备供试品溶液μL，平行3份，分别按照对照品与供试品0.8∶1、1∶1、1.2∶1的比例加入一定量对照品溶液，每一份平行测定3次，计算得各成分的加样回收率，哈巴苷、哈巴俄苷和肉桂酸平均回收率分别为95.87%、96.81%、.21%，RSD分别为0.99%、1.04%、1.29%。
2.5.7玄参药材中3种药效成分含量测定取各产地不同等级玄参粉末按照“2.2”项下制备方法操作，进样分析，记录峰面积，计算各组分含量。结果见表4。不同批次玄参药材中化学成分的质量分数分别为哈巴苷0.18%～2.89%、哈巴俄苷0.01%～0.35%，肉桂酸0.01%～0.24%，3种化学成分含量差异悬殊，提示部分批次玄参可能存在整体质量较高或偏低的情况。
3讨论
3.1不同批次、不同等级玄参药材特征谱图的相似度及差异性分析
根据对30批次不同等级玄参药材的80组指纹图谱进行分析，7个共有峰的相对保留时间RSD值均小于2.0%，提示该7种化学成分在不同批次不同等级玄参药材中稳定存在；而7个共有峰的相对峰面积RSD值则表现异常，提示不同批次、不同等级玄参药材中主要化学成分的含量存在明显差异。相似度结果分析中，约有5%的指纹图谱与对照药材的相似度低于0.7，考虑不合格药材的可能性；12.5%的相似度在0.7～0.8，提示化学成分总量与对照药材差异较大的可能性；其他相似度约40%处于0.8～0.9，42.5%大于0.9，与对照药材特征图的差异性较小，提示整体质量较佳；其中，S5、S16、S19、S23、S29批次玄参指纹图谱的等级差异甚微，相似度值均大于0.9，考虑优质药材的可能性，建议全部划分为一等品。从等级角度分析相似度数据，未发现一等品优于二等品、二等品优于三等品的规律，提示原有的等级划分标准与所测化学成分之间无相关性。
3.2不同批次、不同等级玄参药材中3种药效成分含量差异分析
在考察的30批次玄参药材中，不同批次不同等级玄参药材中3种药效成分含量差异悬殊，建议在制定新等级质量标准时，不能笼统地将每批次玄参均分成一、二、三等。如浙江磐安（S1、S2、S3、S4、S24、S25）中3种药效成分的质量分数均较高，建议在制定新的质量标准时，可考虑将其全部划分为一等货；而对于3种主要药效成分含量特别低的药材，可考虑将其全部划分为三等货，甚至为不合格药材。此外，3种药效成分总量与已有等级标准之间存在正相关的有9批次，即同一批次3种药效成分的总量服从一等优于二等，二等优于三等的规律。而其他批次不同等级的玄参药材与3种药效成分的含量之间则无规律可循，占比为70%，提示玄参药材的表观性状不能全面客观准确反映等级质量标准。鉴于药材的品相、大小与药效成分含量高低之间的正相关不具普遍性，建议在制定新的等级质量标准时，结合化学成分的差异性，考虑在已有玄参等级质量标准基础上，增加哈巴苷、哈巴俄苷、肉桂酸3种药效成分的含量标准。
本实验采用HPLC-DAD法在获取玄参药材指纹图谱的同时测定哈巴苷、哈巴俄苷和肉桂酸含量，该方法分离效果好，操作简便，灵敏度高，客观可靠，为控制玄参内在质量提供参考。基于对本实验结果的分析，建议在原有等级划分标准的基础上，引入化学成分群的指纹图谱和主要化学成分的含量测定指标，为制定新的玄参药材等级质量标准提供更为科学、详实的依据。
参考文献（略）
来源：刘芳，周小江，袁志鹰，林美妤，胡耀梅，陈龙，陈乃宏.基于指纹图谱结合多指标测定的玄参药材等级质量研究[J].中草药,,50(5):-.
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